تعیین توالی اگزوم (Exome Sequencing)

معرفی بیماری:

آتروفی عضلانی نخاعی (Spinal muscular atrophy) یک اختلال ژنتیکی است که کنترل حرکت عضلات را تحت‌تأثیر قرار می‌دهد. این اختلال در اثر ازبین‌رفتن سلول‌های عصبی تخصص یافته‌ای به نام نورون‌های حرکتی (motor neurons) در نخاع و بخشی از مغز که به نخاع متصل است و ساقه مغز (the brainstem) نام دارد، ایجاد می‌شود. ازبین‌رفتن نورون‌های حرکتی منجر به ضعف و ازبین‌رفتن (آتروفی -atrophy) ماهیچه‌های مورداستفاده برای انجام فعالیت‌هایی مانند سینه‌خیز رفتن، راه‌رفتن، نشستن و کنترل حرکات سر می‌شود. در موارد شدید آتروفی عضلانی نخاعی، ماهیچه‌های مورداستفاده برای تنفس و بلع نیز تحت‌تأثیر قرار می‌گیرند. انواع متفاوتی از آتروفی عضلانی نخاعی تشخیص‌داده‌شده است که بر اساس الگوی علایم، شدت ضعف عضلانی و سن آغاز مشکلات عضلانی، از یکدیگر تشخیص داده می‌شوند.

باتوجه‌به اینکه %۹۵ الی %۹۸ موارد بیماری SMA ناشی از حذف هموزیگوت اگزون‌های ۷ و ۸ ژن SMN1 هستند، اکثریت بیماران مبتلا به SMA از طریق بررسی این نوع جهش با استفاده از تکنیک MLPA قابل تشخیص هستند. مزیت اصلی تکنیک‌های سیتوژنتیک مولکولی توانایی بررسی نواحی متعدد ژنومیک در یک نوبت آزمایش بوده که امکان بررسی هم زمان موارد زیر را فراهم می‌کند:

• تشخیص Deletion اگزون‌های ۷ و ۸ ژن SMN1
• تعیین تعداد کپی ژن SMN2 جهت مشخص‌شدن نوع بیماری و تخمین پرگنوز آن
• تعیین وسعت ناحیه حذف شده از طریق تعیین تعداد کپی ژن‌های دیگر  SMA Region: (BIRC1,GTF2H2,RAD17,CDH6)
• امکان بررسی ناقلین (Carrier Detection) حتی در صورت در دسترس نبودن افراد مبتلا
• تشخیص پیش از تولد بیماری مذکور بر روی نمونه پرزهای جفتی یا مایع آمنیوتیک
• دیستروفی عضلانی دوشن و بکر Dushenne/ Becker Muscular Dystrophy

معرفی بیماری:

فرم‌های دوشن (Duchenne) و بکر (Becker) از دیستروفی‌های عضلانی دو بیماری وابسته به هم هستند که به طور اولیه عضلات اسکلتی که برای حرکت مورداستفاده قرار می‌گیرند و عضلات قلبی را درگیر می‌کنند. این فرم‌های دیستروفی عضلانی تقریباً به طور انحصاری در مردان اتفاق می‌افتند. دیستروفی‌های عضلانی دوشن و بکر علایم و نشانه‌های یکسانی دارند و در اثر جهش‌های مختلف در یک ژن ایجاد می‌شوند. دو بیماری از نظر شدت علایم، سن شروع و سرعت پیشرفت متفاوت هستند. در پسرهای مبتلا به دیستروفی عضلانی دوشن، ضعف عضلانی در اوایل کودکی آغاز شده و به‌سرعت بدتر می‌شود. کودکان مبتلا ممکن است تأخیر در تکامل مهارت‌های حرکتی مانند ایستادن، نشستن و راه‌رفتن داشته باشند. آنها معمولاً تا سنین نوجوانی به ویلچر وابسته می‌شوند. علایم و نشانه‌های دیستروفی عضلانی بکر معمولاً خفیف‌تر بوده و بیشتر متغیر است. در اغلب موارد ضعف عضلانی در مراحل دیرتر کودکی یا سنین بلوغ ظاهر شده و با سرعت کمتری پیشرفت می‌کند.

در دو فرم دوشن و بکر دیستروفی عضلانی با یک بیماری قلبی به نام کاردیومیوپاتی (cardiomyopathy) در ارتباط هستند. این نوع از بیماری قلبی، عضله قلبی را ضعیف می‌کند و از پمپاژ مؤثر خون توسط قلب جلوگیری می‌کند.

ازآنجایی‌که %۷۲ الی %۷۵ موارد بیماری دوشن و %۹۱ الی %۹۵ موارد بیماری بکر ناشی از Deletion یا Duplication در اگزون‌های ژن دیستروفین هستند، استفاده از روش‌های نوین سیتوژنتیک مولکولی مانند (MLPA) جهت تشخیص ژنتیکی این بیماری‌ها دارای مزیت‌های زیر است:

• توانایی بررسی Deletion در همه اگزون‌های (۷۹ اگزون) ژن دیستروفین (روش‌های رایج تشخیصی به دلیل محدودیت‌های تکنیکی صرفاً” محدود به بررسی چند اگزون بوده‌اند)
• توانایی بررسی Duplication در اگزون‌های ژن دیستروفین (تکنیک‌های رایج تشخیصی تاکنون قادر به تشخیص Duplication نبوده‌اند)
• بررسی هم زمان جهش‌های فوق در همه اگزون‌ها در مدت بسیار کوتاه‌تر در مقایسه با تکنیک‌های تشخیصی قدیمی‌تر
• توانایی بررسی ناقلین (Carrier Detection) حتی در صورت در دسترس نبودن افراد مبتلا
• امکان تشخیص پیش از تولد بیماری‌های مذکور بر روی نمونه پرزهای جفتی یا مایع آمنیوتیک 
• نوروپاتی‌های ارثی حسی حرکتی Hereditary Motor Sensory Neuropathy Type1 یا Charcot-Marie-Tooth disease Type I

معرفی بیماری:

بیماری شارکو-ماری-توث Charcot-Marie-Tooth disease یک گروه از اختلالات پیش‌رونده است که اعصاب محیطی را تحت‌تأثیر قرار می‌دهد. اعصاب محیطی، مغز و نخاع را به ماهیچه‌ها و سلول‌های حسی (sensory cells) که حس‌هایی مانند لامسه، درد، گرما و صدا را تشخیص می‌دهند، متصل می‌کنند. آسیب به اعصاب محیطی می‌تواند منجر به ازبین‌رفتن حس و تحلیل ماهیچه (آتروفی -atrophy) در پاها و دست‌ها شود. نوروپاتی‌های ارثی حسی حرکتی شایع‌ترین علت ژنتیکی نوروپاتی بوده که به دو گروه عمده CMT1 و CMT2  طبقه‌بندی می‌شوند. CMT1 بخش عمده‌ای از کل موارد را شامل شده که در این گروه %۷۶ الی %۹۰ از موارد ناشی از Duplication در ژن PMP22 هستند. با استفاده از روش‌های نوین سیتوژنتیک مولکولی، بررسی جهش مذکور جهت تشخیص CMT1A امکان‌پذیر شده است. مزایای استفاده از این تکنیک‌های تشخیصی در این زمینه عبارت‌اند از:

• تشخیص PMP22 Gene Duplication جهت تشخیص CMT1A
• تشخیص PMP22 Gene Deletion جهت تشخیص بیماری Hereditary NEUROPATHY with liability to Pressure Palsies) HNPP)
• تعیین وسعت ناحیه حذف یا مضاعف شده از طریق تعیین تعداد کپی ژن‌های دیگر CMT1 Region) BX089850 ,TEKT3 ,FLJ25830 ,COX10)
• امکان بررسی ناقلین (Carrier detection) حتی در صورت در دسترس نبودن افراد مبتلا
• تشخیص پیش از تولد بیماری مذکور بر روی نمونه پرزهای جفتی یا مایع آمنیوتیک

در این روش همه اگزون‌ها (توالی‌های کدکننده پروتئین‌ها) در بیش از نوزده هزار ژن شناخته شده تعیین توالی و آنالیز می‌شوند. به‌علاوه در مرحله آنالیز، داده‌ها با تمرکز بیشتر و عمیق‌تری بر بیش از پنج هزار ژن شناخته شده که در بیماری‌ها نقش دارند به‌صورت هدفمند و جامع آنالیز می‌شوند. این شیوه از تحلیل داده‌ها که علاوه بر تکیه بر علایم بالینی در سطح دیگری نیز تحلیل خواهند شد در نوع خود منحصربه‌فرد و کامل‌تر از بسته‌های موجود حتی در کشورهای پیشرفته است. بر اساس علایم بالینی و یافته‌های آزمایشگاهی بیمار، مجموعه‌ای از ژن‌های زیر مورد آنالیز قرار می‌گیرند:

کاربردهای تعیین توالی اگزوم:

• بیماری‌های پیچیده که می‌توانند در اثر جهش در ژن‌های متعدد و متفاوت ایجاد شوند (مانند اختلالات نورولوژیک، اختلالات نوروموسکولار، اختلالات اسکلتال و …)
• موارد عقب‌ماندگی ذهنی و تأخیر تکامل
• ناهنجاری‌های متعدد مادرزادی
• بیماری‌هایی با علت ناشناخته

محدودیت‌های تعیین توالی اگزوم:

در این بررسی نواحی کدکننده (اگزون‌ها) همه ژن‌های شناخته شده در انسان تاکنون (تقریباً ۱۹ هزار ژن) تعیین توالی می‌گردد؛ اما صرفاً ژن‌هایی که مرتبط با بیماری‌های ژنتیکی هستند (تاکنون شناخته شده‌اند)، مورد بررسی و آنالیز کلی قرار گرفته، سپس واریانت‌های واقع در ژن‌های مرتبط با بیماری فرد مورد آزمایش به‌صورت جزئی و دقیق مورد بررسی و آنالیز تخصصی قرار می‌گیرند. ازاین‌رو نهایتاً وضعیت افراد از نظر مبتلا بودن از نظر همین گروه از بیماری‌ها مشخص می‌شود و هیچ بیماری دیگری در این آزمایش مورد بررسی قرار نمی‌گیرد.

پوشش (Coverage) این تست ۱۰۰% نیست. به این معنی که ممکن است جهش بیماری‌زا در فرد مورد بررسی وجود داشته باشد؛ اما این تکنیک به دلیل محدودیت‌های شناخته شده در آن، قادر به شناسایی جهش نباشد.

این آزمایش برای تشخیص جهش‌های نقطه‌ای و حذف‌ها و مضاعف‌شدگی‌های کوچک DNA در مناطق کدکننده ژنوم (اگزون‌ها) و بخش اندکی از DNA غیر کدکننده همراه آنها (حدود ۲۰bp از هر طرف) طراحی شده است، بنابراین گزارش نهایی حاوی هیچ اطلاعاتی در مورد قسمت‌های دیگر ژن‌ها از جمله بخش‌های تنظیمی نیست.

این آزمایش قادر به تشخیص افزایش تکرارهای سه‌تایی و ناهنجاری‌های کروموزومی مانند اختلالات تعدادی و ساختاری کروموزوم‌ها و حذف‌ها و مضاعف‌شدگی‌های بزرگ DNA نمی‌باشد.

توانایی این آزمایش برای تشخیص دادن واریانت‌های جزئی (به‌عنوان‌مثال موزاییسم سلول‌های سوماتیک) محدود است. واریانت‌هایی که در کمتر از ۵۰% از سلول‌های هسته‌دار بیمار وجود داشته باشند، قابل تشخیص نیستند.